Обработка Er:YAG-лазером (2940 нм) стимулирует рост волос за счет усиления экспрессии Wnt 10b и β-катенина у мышей C57BL/6

Цель: оценить роль эрбиевого лазера YAG с длиной волны 2940 нм в росте волос у мышей C57BL/6.

Методы: Анаген был экспериментально вызван депиляцией. Здоровые мыши C57BL/6 (n=22) были случайным образом разделены на четыре группы, получавшие лечение лазером или миноксидилом или комбинированное лечение лазером и миноксидилом. Цвет кожи каждой мыши наблюдали каждый день. Регистрировали время от телогена (розовый цвет кожи) до фазы анагена (черная окраска) и от анагена (черная окраска) до катагена (все волосы выросли из депилированной кожи). Анализ гематоксилина и эозина (H& E) проводили через пятнадцать дней после первой обработки для каждой группы, чтобы наблюдать за волосяными фолликулами и показателем цикла роста волос. Вестерн-блоттинг использовали для определения уровней экспрессии Wnt 10-b и β-катенина.

Результаты: Черная пигментация началась значительно раньше как в группе лазера, так и в группе комбинированного лечения, чем в контрольной группе. Более того, время от анагена до катагена в группах лазера, миноксидила и комбинации было значительно короче, чем в контрольной группе. Гистопатология с окрашиванием H& E показала явное увеличение количества волосяных фолликулов в фазе анагена, вызванное обработкой 2940 нм эрбиевым лазером и миноксидилом. Точно так же процент волосяных фолликулов в анагене VI составлял 19, 5%, 37, 5%, 41, 5% и 44% в контрольной, лазерной, миноксидиловой и комбинированной группах соответственно. Вестерн-блоттинг показал, что уровни как Wnt 10b, так и β-катенина были значительно повышены при обработке лазером Er:YAG с длиной волны 2940 нм.

Заключение. Наши результаты показали, что Er: YAG-лазер с длиной волны 2940 нм может способствовать росту волос, индуцируя переход цикла волос от фазы телогена к фазам анагена у мышей C57BL/6 посредством повышающей регуляции Wnt 10b и β-катенина. Эти результаты показывают, что Er: YAG-лазер с длиной волны 2940 нм может быть потенциальным средством лечения выпадения волос.

Введение

Выпадение волос обычно не считается опасным для жизни явлением. Тем не менее, это часто влияет на социальные взаимодействия и психологическое благополучие людей. Волосы рассматриваются как одна из дополнительных структур покровов, включающая сальные железы, ногти и сладкие железы. Рост волос цикличен с тремя различными фазами, включая фазы роста (анаген), инволюции (катаген) и покоя (телоген).

Хотя число пациентов, страдающих потерей слуха, резко возросло, только два препарата — финастерид и миноксидил — одобрены для использования в лечении выпадения волос. Миноксидил широко используется у пациентов с андрогенной алопецией для стимулирования роста волос путем индукции перехода волосяных фолликулов из стадии телогена в стадию анагена. Однако неблагоприятные дерматологические эффекты, такие как шелушение, сухость и дерматит, также могут быть вызваны введением миноксидила. Поэтому необходимо срочно разрабатывать новые методы лечения.

Лазеры и источники света уже много лет широко используются в медицине и немедицинских целях. Хорошо известно, что низкоинтенсивная лазерная терапия (LLLT) эффективна и безопасна при лечении выпадения волос. Сообщалось о различных НИЛТ для лечения выпадения волос, таких как гелий-неоновый лазер, эксимерный лазер и ПУФА, и сообщалось о некоторых успешных случаях. Помимо LLLT, для лечения выпадения волос также были опробованы высокоэнергетические лазеры. Ли и др. сообщили о фракционном лазере на эрбиевом стекле с длиной волны 1550 нм для лечения выпадения волос по женскому типу. Их результаты показывают, что высокоэнергетический фракционный лазер на эрбиевом стекле с длиной волны 1550 нм может быть эффективным и безопасным вариантом лечения женщин с облысением по женскому типу. Хотя механизм роста волос, вызванного лазером, изучен недостаточно, был подтвержден большой потенциал различных типов лазеров в лечении выпадения волос. В этом исследовании мы стремились оценить роль эрбиевого лазера YAG с длиной волны 2940 нм в росте волос у мышей.

Материалы и методы

Животные

Здоровых мышей C57BL/6 (возраст 6-8 недель, вес 20-30 г) получали из Центра лабораторных животных Уханьского университета. Для последующих экспериментов использовали мышей в возрасте 6-8 недель, поскольку мыши на этой стадии находятся в стадии телогена цикла волосяного покрова. Мышам давали корм для грызунов и воду без ограничений при влажности (35-60%), температуре (23±2°C) и 12-часовом цикле света и 12-часовом цикле темноты. Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (публикация Национального института здравоохранения № 80-23) и институциональными этическими рекомендациями по экспериментам на животных Уханьского университета.

Индукция анагена

Как описано ранее, анаген был экспериментально вызван депиляцией. Вкратце, всех мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 2, 5% хлоралгидрата в дозе 0, 1 мл/10 г массы тела мышей. Все волосяные фолликулы были обозначены в телогене по розовому цвету кожи спины. Смесь воска и канифоли наносили на кожу спины (примерно 4 см × 4 см), и все стержни волос удаляли путем отслаивания смеси воска и канифоли. Сообщалось, что удаление всех волосяных стержней немедленно вызывает высоко синхронизированный рост волос.

Уход

Мышей случайным образом разделили на четыре группы (n=22) для изучения активности стимулирования роста волос. Кожу на спине очищали перед обработкой для всех групп. Контрольная группа не получала никакого лечения. В группе лазерного лечения проводилося сеанс с использованием Er: YAG-лазера с длиной волны 2940 нм с микролинзой, выровненной в матрице 9 × 9 (81) точек (пикселей) при настройке 1200 мДж/см2 и площадь пятна 1, 5 см × 4, 0 см. Во время каждого сеанса лечения выполнялось два лазерных прохода. Каждая мышь получала 3 обработки с интервалом в одну неделю. В группе лечения миноксидилом ежедневно применялась 5% настойка миноксидила (Wanma Group, Чжэцзян, Китай) в течение 3 недель. В группе комбинированного лазерного лечения с миноксидилом количество проходов, размер матрицы и уровень энергии, использованной для лечения Er: YAG-лазером с длиной волны 2940 нм, были такими же, как и в группе лазерного лечения; тем временем 5% настойку миноксидила (Wanma Group, Китай) лечили каждый день в течение 3 недель. Цвет кожи каждой мыши наблюдали каждый день. На анаген указывает черная окраска. В нашем исследовании мы использовали черную окраску, покрывающую примерно половину депилированного участка кожи, как признак анагена. Регистрировали временной интервал между телогеном (начало лечения) и анагеном. Кроме того, мы также зафиксировали временной интервал между анагеном и катагеном (все волосы выросли из депилированной кожи).

Анализ гематоксилина и эозина (H& E)

Через пятнадцать дней после первой обработки для каждой группы по четыре мыши из каждой группы умерщвляли и удаляли кожу со спины. Кожу спины фиксировали в 4% параформальдегиде при 4°С в течение не менее 24 часов и заливали в парафиновые блоки для получения продольного и поперечного срезов. Окрасьте срезы гематоксилином и эозином. Репрезентативные области были выбраны из цифровых микрофотографий при фиксированном увеличении 400×.

Оценка цикла волос

Слайды, окрашенные гематоксилином и эозином, были сфотографированы с использованием цифровой микрофотографии для оценки циклов роста волос. Пятьдесят волосяных фолликулов, идентифицированных на срезах, оценивали для каждой мыши. Оценка цикла волос рассчитывалась следующим образом: волосяным фолликулам в анагене VI приписывалась болезненность 100 баллов, в раннем катагене (катаген I-катаген III) — 200 баллов, в среднем катагене (катаген IV-катаген V) — 300 баллов., а в позднем катагене (катаген VI-VIII) — 400 баллов. Также был рассчитан процент каждой стадии цикла роста волос.

Вестерн-блоттинг

Методы вестерн-блоттинга были такими, как описано ранее. Вкратце, белки экстрагировали из образцов тканей через 24 часа после первой обработки для каждой группы и количественно оценивали с помощью анализа Брэдфорда. Равные количества белка подвергали SDS-PAGE и переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF). Первичными антителами, используемыми для вестерн-блоттинга, были биотиновые поликлональные кроличьи антитела против Wnt 10b (bs-3662r; разведение 1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния, США) и моноклональные кроличьи антитела против β-катенина (#9582; разведение 1: 1000; Cell Signaling Technology, Бостон, Массачусетс, США). Все опыты повторялись трижды.

Статистический анализ

Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Данные анализировали с помощью программного обеспечения SPSS (версия 17.0). Статистическую оценку данных проводили с использованием теста однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Значения P< 0, 05 считались статистически значимыми.

Полученные результаты

Влияние лазера Er:YAG с длиной волны 2940 нм на рост волос

Мышей в возрасте 6-8 недель синхронизировали путем депиляции. О переходе волосяных фолликулов из фазы телогена в фазу анагена свидетельствует черная пигментация. Наши результаты показали, что продолжительность начала черной пигментации значительно различалась в четырех группах. Черная пигментация началась значительно раньше в группе, получавшей лазер и миноксидил, чем в контрольной группе, что свидетельствует о том, что Er:YAG-лазер с длиной волны 2940 нм индуцировал черную окраску у мышей C57BL/6. В комбинированной группе (как с лазерным лечением, так и с введением миноксидила) время от фазы телогена до фазы анагена было значительно короче, чем в контрольной группе. Кроме того, для каждой группы регистрировали время от анагена (черный цвет кожи) до катагена (все волосы выросли из депилированной кожи). Наши результаты показали, что время от анагена до катагена в группах лазера, миноксидила и комбинации было значительно короче, чем в контрольной группе. Время от анагена до катагена в группе комбинированной терапии было значительно короче, чем в группе миноксидила, что позволяет предположить, что комбинированное лечение Er:YAG-лазером с длиной волны 2940 нм и миноксидилом может дополнительно стимулировать рост волос.

Влияние лазера Er:YAG с длиной волны 2940 нм на цикл роста волос

Гистопатологию с окрашиванием H&E проводили через 15 дней после первой обработки для каждой группы. Наши результаты показали явное увеличение количества волосяных фолликулов в фазе анагена в группе лазера, миноксидила и комбинации по сравнению с контрольной группой. Анагеновые волосяные луковицы были больше в группах с лечением (лазер, миноксидил и комбинированная группа) по сравнению с контрольной группой, где большинство волосяных фолликулов находились в телогене. Оценка цикла волос для группы лазера составила 171, для миноксидила — 165, а для комбинации — 158, что свидетельствует о том, что большинство волосяных фолликулов находились в фазе анагена или ранней фазе катагена. Принимая во внимание, что оценка цикла роста волос для группы лазерной терапии составила 336, что свидетельствует о том, что большинство волосяных фолликулов находились в фазе среднего или позднего катагена. Подсчитав процент волосяных фолликулов на каждой стадии цикла роста волос, мы обнаружили, что фолликулы в анагене VI составляют 19,5%, 37,5%, 41,5% и 44% в контрольной, лазерной, миноксидиловой и комбинированной группах соответственно.

Обработка лазером Er:YAG с длиной волны 2940 нм индуцировала экспрессию Wnt 10b и β-катенина

Механизм, лежащий в основе перехода цикла роста волос от телогена к анагену, изучен недостаточно. Однако сообщалось, что в этот переход вовлечены многие сигнальные пути, такие как Wnt, BMP, Shh и FGF. Сообщалось, что β-катенин может индуцировать переход цикла роста волос от фазы телогена к фазе анагена. Также сообщалось, что Wnt 10b может индуцировать переход от телогена к анагену через канонические пути передачи сигналов Wnt, чтобы способствовать росту волосяных фолликулов. В этом исследовании, чтобы выяснить механизм воздействия лазера Er:YAG с длиной волны 2940 нм на рост волос, для определения уровня экспрессии Wnt 10b и β-катенина был использован вестерн-блоттинг. В нашем исследовании мы обнаружили, что уровни Wnt 10b были значительно выше в группах лазера, миноксидила и комбинации, чем в контрольной группе. Более того, уровни β-катенина были выше в группах лазерной и комбинированной терапии, чем в контрольной группе. В то время как в группе миноксидила не наблюдалось никакой разницы по сравнению с контрольной группой. В совокупности эти данные показали, что обработка Er:YAG-лазером с длиной волны 2940 нм частично способствовала росту волос за счет активизации Wnt 10b и β-катенина.

Обсуждение результатов

Выпадение волос является одной из самых распространенных хронических дерматологических проблем во всем мире. Выпадение волос может быть вызвано несколькими причинами, такими как генетическая наследственность, уровень местного андрогена, сон и секреция кожного сала. Хотя это и не опасно для жизни, выпадение волос часто может иметь серьезные психосоциальные последствия, особенно у молодых людей. Миноксидил является широко используемым препаратом, одобренным FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) для лечения андрогенной алопеции путем индукции перехода цикла волос от фазы телогена к фазе анагена. Однако неблагоприятные дерматогогические эффекты, такие как сухость, местное раздражение и дерматит, также могут быть вызваны лечением миноксидилом.

Лазерная терапия кажется эффективной и безопасной при лечении выпадения волос, хотя механизм, лежащий в основе этого, недостаточно ясен. Сообщалось, что НИЛИ, такие как гелий-неоновый лазер, эксимерный лазер и ПУФА, эффективны при лечении выпадения волос. В отличие от НИЛТ, относительно меньше сообщений об использовании высокоэнергетических лазеров для лечения выпадения града. Ли и др. сообщили о фракционном лазере на эрбиевом стекле с длиной волны 1550 нм при лечении выпадения волос по женскому типу и обнаружили, что это лечение может быть эффективным и безопасным вариантом лечения для женщин с облысением по женскому типу. Сообщалось, что абляционный фракционный Er:YAG-лазер (2940 нм) является многообещающим вариантом для восстановления поверхности кожи и уменьшения травматических рубцов. Однако роль лазера Er:YAG с длиной волны 2940 нм в росте волос не выяснена. В этом исследовании мы обнаружили, что лазер Er:YAG с длиной волны 2940 нм может значительно стимулировать рост волос, индуцируя переход цикла волос от фазы телогена к фазам анагена у мышей C57BL/6.

Мыши C57BL/6 являются полезными моделями, используемыми для скрининга агентов, стимулирующих рост волос. Черный пигмент вырабатывается только во время анагена, что делает цвет кожи видимым индикатором циклов роста волос. Наши результаты показали, что черная пигментация началась значительно раньше в группе лазера, чем в контрольной группе, предполагая, что лазер Er:YAG с длиной волны 2940 нм индуцировал переход телогена в анаген у мышей C57BL/6. В группе, обработанной как лазером Er:YAG с длиной волны 2940 нм, так и миноксидилом, время от фазы телогена до фазы анагена было значительно короче, чем в контрольной группе и в группе с лазером. Эти результаты могут быть частично вызваны повышенной абсорбцией миноксидила после лечения абляционным фракционным лазером Er:YAG (2940 нм). Сообщалось, что лазерная обработка Er:YAG может увеличить поглощение трансдермальной доставки пептидов в 3-140 раз по сравнению с неповрежденной кожей. Кроме того, гистопатология с окрашиванием H&E через 15 дней после первой обработки в каждой группе показала явное увеличение количества волосяных фолликулов в фазе анагена в группе, получавшей лазер, миноксидил и комбинацию, по сравнению с контрольной группой. Анагеновые волосяные луковицы были больше в группах с лечением (лазер, миноксидил и комбинированная группа) по сравнению с контрольной группой. Наши результаты показывают, что лазерное лечение Er:YAG с длиной волны 2940 нм способствует росту волос, индуцируя переход цикла волос от фазы телогена к фазам анагена у мышей C57BL/6.

Сообщалось, что многие сигнальные пути участвуют в переходе цикла роста волос от телогена к анагену, такие как Wnt, BMP, Shh и FGF. Сообщалось, что Wnt 10b может индуцировать переход от телогена к анагену через канонические пути передачи сигналов Wnt, чтобы способствовать росту волосяных фолликулов. В этом исследовании мы обнаружили, что уровни как Wnt 10b, так и β-катенина были значительно выше в группах лазера, миноксидила и комбинации, чем в контрольной группе. В совокупности эти данные показали, что обработка Er:YAG-лазером с длиной волны 2940 нм частично способствовала росту волос за счет активизации Wnt 10b и β-катенина.

В заключение

В этом исследовании мы сообщаем о роли Er:YAG-лазера с длиной волны 2940 нм в росте волос. Наши результаты показывают, что Er:YAG-лазер с длиной волны 2940 нм может способствовать росту волос, индуцируя переход цикла волос от фазы телогена к фазам анагена у мышей C57BL/6 посредством активизации Wnt 10b и β-катенина. Наши результаты показывают, что Er:YAG-лазер с длиной волны 2940 нм может быть потенциальным средством лечения выпадения волос.